МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ 
АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
Інститут фтизіатрії і пульмонології ім. Ф.Г. Яновського АМН України

 

 

МІКРОБІОЛОГІЧНІ МЕТОДИ ОБСТЕЖЕННЯ ХВОРИХ 
НА ТУБЕРКУЛЬОЗ
(на підставі нових даних про особливості біологічного розвитку M.tuberculosis)
(методичні рекомендації)

 

 

 

 

 
 
Київ 2001
 
Заклад-розробник:
Інститут фтизіатрії і пульмонології ім. Ф.Г.Яновського АМН України
Вінницька проблемна лабораторія з вивчення мікробіології туберкульозу
 
Укладачі:
Журило О.А., д-р мед. наук, доцент, тел. 8-044-277-55-11
Власенко В.В., д-р біологіч. наук, професор, тел. 8-0432-27-23-46 
Барбова А.І., ст. наук. співроб., канд. мед. наук, тел. 8-044-277-55-11
Конопко І.Г., ст. наук. співроб., тел. 8-0432-27-23-46
Шмирко Є.О., ст. наук. співроб., тел. 8-0432-27-23-46
Черниш І.М.,  наук. співроб., тел. 8-0432-27-23-46
Василенко С.П.,  наук. співроб., тел. 8-0432-27-23-46
Трофімова П.С., мол. наук. співроб., тел. 8-044-277-55-11
В’ялих Ж.Е., мол. наук. співроб., тел. 8-044-277-55-11

Голова експертної комісії – доктор медичних наук, професор Мельник В.М.

 
Рецензенти:  д-р мед. наук,  професор   Мельник В.П. 
                        д-р мед. наук, професор    Бялик Й.Б.

 

 

 
 
 МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ 
АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
Інститут фтизіатрії і пульмонології ім. Ф.Г. Яновського АМН України

                         “УЗГОДЖЕНО”                                            ЗАТВЕРДЖУЮ
Начальник лікувально-профілактичного                     Головний   державний
  управління Президії АМН України                          санiтарний лiкар України
                                                                             
_______________________В.П.Неділько                    _____________О.О.Бобильова
“____”______________200_ р.                                      “      “                                 200_ р.                                                                                          

“УЗГОДЖЕНО”
                  Головний  фтизіатр 
                      МОЗ України
Академік АМН України, д-р мед. наук,
професор _____________Ю.І.Фещенко
“____”  ______________200_ р.	“УЗГОДЖЕНО”
Начальник управління профілактики
 соціально-небезпечних хвороб та СНІДу  та формування здорового способу життя
МОЗ України
 ______________ Л.В.Бочкова
 “____”  ______________200_ р.	

 

МІКРОБІОЛОГІЧНІ МЕТОДИ ОБСТЕЖЕННЯ ХВОРИХ 
НА ТУБЕРКУЛЬОЗ
(на підставі нових даних про особливості біологічного розвитку M.tuberculosis)
 
(методичні рекомендації)

 

 
 
Київ 2001

ВСТУП
 
Туберкульоз, за визнанням провідних учених і фтизіатрів, продовжує залишатися глобальною проблемою. За прогнозами ВООЗ на протязі наступного десятиріччя у світі передбачається 90 млн. нових випадків туберкульозу (Фещенко Ю.І., Мельник В.М.,1998; Фещенко Ю.І., Ільницький І.Г., Мельник В.М., Панасюк О.В. 1998) .
Вельми актуальна сьогодні проблема туберкульозу й в Україні. Поряд з прогресивним зростанням захворюваності на туберкульоз в останні роки почали виявлятися клінічні форми цієї недуги, які майже не зустрічалися в останні десятиріччя: казеозна пневмонія, тотальні полікавернозні ураження легень, туберкульоз кишечнику, гортані, периферичних лімфатичних вузлів. Ситуація ускладнюється тим, що діагностика деяких  форм туберкульозу надзвичайно ускладнена внаслідок олігобацилярності процесу (Мельник В.М., 1999).
Як показує досвід, хворі на туберкульоз виявляються недостатньо і не отримують кваліфікованої допомоги. Це зумовлено відсутністю науково обґрунтованих рекомендацій і нормативних документів з цієї проблеми.  
Під впливом антибактеріальної терапії, яка проводиться у хворих на туберкульоз, МБТ із типових форм трансформуються в інші, в тому числі в ті, які фільтруються. Ці морфологічні форми з новими біологічними властивостями зберігають вірулентність, вони спроможні затримати одужання хворого, або ж спричинити рецидив захворювання. Хворі на туберкульоз у процесі лікування перестають виділяти типові форми збудника хвороби, але продовжують протягом довгого часу залишатися джерелом туберкульозної інфекції. 
Дослідники дотримуються думки про те, що наявність у хворих клінічних ознак туберкульозу при негативних бактеріоскопії та посіві вимагає допоміжних методів дослідження для виявлення змінених форм збудника. 
Існуючі методи мікроскопічної діагностики малоефективні внаслідок олігобацилярності патологічного матеріалу. Поряд із мікроскопією мазків використовують бактеріологічний метод. Ріст перших колоній на класичних середовищах з`являється через 30-60 діб, а для визначення чутливості ще потрібен додатковий термін до 14 - 20 діб.
Існуючі за кордоном технології діагностики дорогі і поки що малодоступні для широкого використання в Україні. Отже, виникає потреба в розробці нових методів сучасної бактеріологічної діагностики захворювання, які б забезпечували не тільки своєчасне виявлення збудника, а й визначення тактики процесу лікування туберкульозу.
Новий метод діагностики, який базується на застосуванні розробленого в Україні живильного середовища ВКГ, за допомогою якого ріст колоній можна отримати за 2-3 доби,  заслуговує уваги і рекомендується для впровадження в практику регіональних бактеріологічних лабораторій (Власенко В.В., 1998).
В даних рекомендаціях авторами коротко викладені стадії біології розвитку мікобактерій туберкульозу і розроблений на цій основі метод бактеріологічної діагностики туберкульозу.
 
1   ОСОБЛИВОСТІ БІОЛОГІЧНОГО РОЗВИТКУ M. TUBERCULOSIS 
 
	З часу відкриття палички Коха уявлення про природу і властивості збудника туберкульозу набули значних змін. Слід зазначити, що в старих культурах МБТ багатьма дослідниками спостерігалася картина різко вираженого поліморфізму: спочатку відбувалося утворення кулеподібних форм, зникнення гранул, пізніше спостерігалося зникнення цитоплазми усередині непошкодженої мембрани і потім фрагментація бактерій у більш-менш безструктурні утворення. При фрагментації цитоплазми мікобактерії не обов'язково втрачали клітинну структуру. У старих культурах спостерігалися сферичні частки, які володіли здатністю проходити через бактеріальні фільтри. При електронній мікроскопії виявлялися поодинокі округлі тільця, що також проходили через бактеріальні фільтри і росли на штучних живильних середовищах. Їх розглядали як L - форми МБТ. Однак, усі ці дані були розрізнені і не давали цілісного уявлення про розвиток збудника туберкульозу (Драбкина Р.О., 1963).
	На живильному середовищі ВКГ особини МБТ, які фільтруються, проходять кілька форм розвитку (Власенко В.В., 1998). При електронному дослідженні фільтрату культури МБТ були виявлені круглі утворення розміром 0,12 - 0,15 мкм, які при сприятливих умовах збільшувалися, набуваючи грушоподібної форми. Вивчення внутрішньої структури цих клітин під електронним мікроскопом дозволило чітко зафіксувати всередині клітини амебоподібні утворення. Материнські клітини, що містили їх, одержали назву артроспори. У період дозрівання артроспори з боку звуженого полюса зсередини виходили позбавлені оболонок амебоподібні клітини, кількість яких збільшувалася шляхом ділення або брунькування. Клітини, які вийшли з артроспори, одержали назву молекути.  Це структури МБТ, що ще не синтезували клітинну стінку. Зовні молекути нагадують L - форми МБТ, тобто структури, що втратили клітинну стінку внаслідок впливу несприятливих факторів (антибіотиків, дезинфікуючих речовин і т.п.). При несприятливих умовах молекути можуть утворювати гігантські клітини і протопласти. Під дією сприятливих факторів навколо молекута утворюється восково-ліпідна оболонка. Молекут поділяється навпіл і в цей період при слабкій восково-ліпідній капсулі в полі зору мікроскопа стають видимі конфігурації, що нагадують диплококи. Під загальною восково-ліпідною оболонкою може утворюватися 2 - 5 і більше клітин, при цьому вся структура набуває вид палички. У пофарбованому  мазку за методом Грам-Муха видна зерниста паличка (зерна Муха), а за Цілем-Нільсоном - паличка рубінового кольору.
	На наступному етапі розвитку паличкоподібні форми при сприятливих умовах переходять у кулеподібні. Цим закінчується стадія розвитку, що умовно названа артроспорою.
	Надалі кулеподібні форми можуть трансформуватися шляхом дроблення, розподілу,  брунькування чи розмножуватися статевим  шляхом.
	Суть процесу дроблення полягає в тому, що в одній кулеподібній клітині, яка збільшується в розмірах, може утворитися 3 і більше перетинок, що  поділяють клітину на декілька нерівномірних частин, з яких потім формуються самостійні кулеподібні й овоїдні клітини. Таке дроблення (розмноження) при сприятливих умовах може повторюватися протягом 24 -72 годин. Якщо клітину в цей період розвитку помістити в нове живильне середовище ВКГ, то через короткий період часу (2 - 5 доби) кулеподібні форми перейдуть у паличкоподібні, характерні для MБТ. При несприятливих умовах усередині кулеподібної клітини відбувається деструкція ядерної речовини й утворюються овоїдні клітини (проартроспори).
	Суть процесу розподілу полягає в тому, що кулеподібна форма поділяється навпіл  зсередини, без зміни зовнішньої структури клітини. У середині клітини утворюються дві рівні частини, які в наступному переходять у самостійні дочірні клітини, що нагадують зовні маленький пиріжок. У кожній дочірній клітині з’являються 1 - 3  відростки (променя) з зростаючою верхівкою у вигляді трубочки. В клітині відбувається збільшення кількості ядерної речовини, яка рівномірно розподіляється по довжині променя. При дозріванні материнська “клітина - пиріжок” відпадає, а ядерна речовина у середині променя поділяється на дрібні гранули. При забарвлені за Цілем-Нільсоном виявляються характерні МБТ. Несприятливі умови приводять до фрагментації ядерної речовини спільно зі стінкою променя. При цьому утворюються округлі клітини, що зменшуючись у розмірі, набувають здатності проходити через бактеріальний фільтр - так звані “фільтруючі” форми збудника туберкульозу.
	Статевий процес розмноження кулеподібних форм MБТ починається з взаємодії двох полярних (“+” і “-”) клітин. При цьому клітини збільшуються в розмірі, нагадуючи дріжжеподібну  клітину, у якої на десяту добу з'являються вирости у вигляді трубочок з подовженою  верхівкою-променем. У клітинах зі зростаючими трубочками відбувається  збільшення кількості  ядерної речовини. Восково-ліпідна капсула материнської клітини поступово нашаровується на зростаючий промінь, а ядерна речовина по трубочці надходить до зростаючої верхівки. В процесі розвитку відбувається сегментація трубочки з ядерною речовиною на всьому протязі. При сприятливих умовах ширина трубочки за розмірами у 10 - 15 разів перевищує товщину кожного сегменту. Далі характерна для трубочки оболонка формується на кожному сегменту. Сегменти збільшуються в поперечному напрямку, утворюючи дугоподібну серповидну структуру. Ядерна речовина розподіляється по дугоподібному утворенню. Надалі оболонка серпоповидних утворень зменшується, ядерна речовина поділяється на маленькі часточки. У цей період розвитку мікобактерій у мазку, забарвленому за Цілем-Нільсоном, спостерігаються рубінові палички, а при забарвлені  мазків за Грам-Мухом - зернисті палички.  При посіві таких паличок на живильне середовище Лëвенштайна-Єнсена  виростають типові колонії МБТ. Внутрішньоочеревинне зараження морських свинок культурами приводить через 1,0-1,5 місяця до розвитку характерної патологічної картини туберкульозу з наступним виділенням із внутрішніх органів і лімфовузлів культури МБТ.
	Суть процесу брунькування полягає в тому, що на бічній поверхні зростаючої трубочки з'являються паростки у вигляді  бруньок чи паличок, що нагадують зубці гребінця. Ці паростки збільшуються в довжину, утворюючи дугоподібні, серповидні форми, що при подальшому розвитку у сприятливих умовах трансформуються в кислотостійкі палички, що виявляються при забарвлені мазків культури за Цілем-Нільсоном і зернисті палички, які виявляються при забарвлені за методом Грам-Мухи. При несприятливих факторах серповидні форми фрагментуються, утворюючи артроспори, форми МБТ, що фільтруються. Весь цикл розвитку мікобактерії просліджується в рідкому живильному кров’яному середовищі ВКГ).
	Розмноження МБТ на щільному живильному середовищі ВКГ має свої особливості. При посіві суспензії культур MБТ на щільне живильне середовище ВКГ після закінчення 24 годин мікобактерії ростуть у виді молекутів і кулеподібних клітин, що поступово переходять у диплококові і паличкоподібні форми. Паличкоподібні форми на 3 -5 добу переходять у   колбоподібні клітини. Поява колбоподібних клітин - це початок утворення артроспори. Якщо в цей період колбоподібні клітини пересіяти на традиційні щільні живильні середовища Льовенштайна-Єнсена  і Фіна-2, то ріст мікроорганізмів буде відсутній. Оброблені стимулюючим комплексом колбоподібні клітини при посіві на традиційні живильні середовища (без малахітового зеленого), через певний період дають ріст у виді типових колоній МБТ.
	При посіві  типових МБТ на голодне рідке живильне середовище ВКГ через 5 - 8 діб на поверхні середовища з’являється  тонка плівка. При мікроскопії мазків, зроблених із плівки, спостерігаються ниткоподібні утворення (капелиції). На цих нитках закладається стадія розвитку спороношення. Капелиції мають значний поліморфізм і мають різну будову: гіллясті, не гіллясті, у виді порожніх трубочок, схожих на ніжне  мереживо чи каркас. На їх поверхні в більшості випадків є потовщення, які можна розцінювати як утворення проартроспори. Нитка через деякий час відпадає від розширення  і утворюється артроспора.
	Різні форми мінливості, трансформації переслідують певну мету – виживання МБТ при несприятливих умовах, збереження життєздатності і, на наш погляд, метод бактеріоскопії є недостатнім для діагностики туберкульозу, а тим більше позалегеневого. У практичній роботі протитуберкульозних закладів “золотим стандартом” діагностики є виділення чистої культури МБТ з патологічного матеріалу на живильних середовищах, тобто бактеріологічний метод. Окрім бактеріоскопії та методу посіву на живильних середовищах необхідно використовувати й зараження лабораторних тварин патологічним матеріалом, тобто біологічний метод.
 
2   ОСОБЛИВОСТІ ВІДБОРУ ТА ПІДГОТОВКИ  ПАТОЛОГІЧНОГО
 МАТЕРІАЛУ  ДЛЯ  МІКРОБІОЛОГІЧНОГО ДОСЛІДЖЕННЯ ПРИ
 ПІДОЗРІ НА ТУБЕРКУЛЬОЗ
 
Особливістю отримання патологічного матеріалу є олігобацилярність, що обумовлює ретельне відношення до проведення цієї важливої роботи, від якої залежить верифікація діагнозу. Для отримання результатів верифікації діагнозу використовують різноманітні біологічні та патологічні матеріали для мікробіологічних досліджень.
Кров для досліджень отримують капілярну або венозну по загальноприйнятим методикам, дотримуючись правил асептики та стерильності інструментів і посуду, який використовується. Менструальну кров у жінок потрібно збирати не тампоном, а методом відсмоктування, або за допомогою ковпачка Кафка.  Перед початком досліджень отриманий матеріал (кров) можна звільнити від еритроцитів, для чого проводять відмивання еритроцитів дистильованою водою (стерильною) з послідуючим центрифугуванням, але при цьому зменшується вірогідність виділення збудника туберкульозу.
Патологічний матеріал отримують при оперативних втручаннях на нирках, статевих органах тощо, ендометричному відборі матеріалу, при біопсіях слизової оболонки бронхів, трансбронхіальній біопсії внутрішньогрудних лімфатичних вузлів, трансбронхіальній  біопсії легень, трансторакальній біопсії легень, торакоскопічній біопсії плеври.
Найбільш доступним патологічним матеріалом при туберкульозі кісток і суглобів є  гнійні специфічні абсцеси. Пунктат таких абсцесів отримують стерильним шприцом, з якого виливають в стерильний посуд і зразу направляють в лабораторію.
Для дослідження може бути отриманий матеріал при оперативному втручанні на кістках і суглобах, який складається з гнійно-некротичних мас, грануляцій, кісткової тканини та інших субстратів.
При бактеріологічному дослідженні синовіальної рідини необхідно безпосередньо перед пункцією провести її відбір в 3,0 % розчин цитрату натрію  (співвідношення 1:1) для попередження згортання.
При туберкульозі лімфатичних вузлів патологічний матеріал (гній) отримують за допомогою пункції і в подальшому роблять так,  як при туберкульозі кісток. З тканинами лімфатичних вузлів, отриманих при операцийному втручанні, роблять як з операцийним матеріалом при інших формах туберкульозу.
При туберкульозі сечо-статевої системи основним матеріалом досліджень являється сеча. При отриманні сечі попередньо зовнішні статеві органи обмивають водою з милом або слабким розчином калію перманганату. Особливо ретельно обробляють зовнішню частину уретри. В стерильний флакон збирають середню порцію ранкової сечі. Відбирання добової сечі для бактеріологічних досліджень не зовсім доцільно, так як в сечі можуть бути бактерицидні субстанції, які не лише пригнічують життєдіяльність МБТ, але протягом доби можуть їх знищувати. До того ж доведено, що при зберіганні сечі більше однієї години, кількість мікробних клітин неспецифічної мікрофлори збільшується в декілька разів.
Сечу з ниркових мисочок збирають в стерильні пробірки при катетеризації кожної нирки окремо.
У чоловіків на бактеріологічні дослідження нерідко направляють сперму, пунктати яєчок, секрет придаткових статевих залоз. При будь-якій локалізації специфічного процесу  масаж придаткових залоз може допомогти виділенню секрету, в якому можуть знаходитись МБТ.
Важливу роль в мікробіологічній діагностиці має отримання харкотиння для досліджень. Якщо медичний працівник не навчить хворого правильно  відкашлювати і збирати харкотиння, то ефективність бактеріологічного виділення МБТ знижується.
При одержанні харкотиння для бактеріологічних досліджень слід врахувати:
-   хворий повинен почистити зуби, ретельно прополоскати ротову порожнину, сплюнути носоглотковий слиз і слину, відкашляти і зібрати тільки вміст дихальних шляхів;  
-   якщо у хворого мало харкотиння, можна з вечора назначити бромгексин або амброксол, а в разі необхідності збирають харкотиння протягом доби, при умові, що воно буде зберігатись в холодильнику (без замерзання), а ранком разом з ранковою порцією буде доставлено в лабораторію;
-   в разі, якщо харкотиння не відходить, то використовують провокуючу інгаляцію (150,0 г NaCl  + 10,0 г NaHCO3 розчиняють в 1 літрі води) протягом 10-15 хвилин;
-   у дітей досліджують промивні води шлунку взяті зондом натщесерце;
-   ранкову порцію харкотиння необхідно доставляти в лабораторію в той же день. 
При необхідності в період транспортування харкотиння заливають подвійним об’ємом одного із консервантів (гліцерин, 2,0 % борна кислота, 10,0 % тринатрій фосфат).
Для того, щоб бути впевненим, що в лабораторію потрапило харкотиння, а не слина, готують мазок-препарат і фарбують за Грамом  згідно до загальноприйнятої методики. При мікроскопії в полі зору повинно бути не менше 10 епітеліальних клітин на 100 підрахованих, при цьому 80,0 % всіх мікроорганізмів знаходяться в нейтрофілах і навколо них, переважають мікроорганізми одного морфологічного типу.
Зразки для мікробіологічних досліджень беруть також при нозотрахіальній  аспірації. Гарним матеріалом для приготування мазка і бактеріологічного посіву є промивні води шлунку, що беруть вранці у хворого.
Для дослідження також можуть бути направлені промивні води бронхів. Для цього хворому натщесерце після попередньої анестезії дихальних шляхів 1,0 % розчином дикаїну зрошують гортань підігрітим ізотонічним (0,9 %) розчином хлориду натрію (10,0 – 15,0 мл) за допомогою гортанного шприца. При цьому тілу хворого потрібно надати такого положення, яке б сприяло попаданню розчину в бронхи ураженої легені. Ізотонічний розчин хлориду натрію, подразнюючи слизову оболонку бронхів, спричиняє посилене виділення слизу. Промивні води бронхів, які виділяються при відкашлюванні, збирають у стерильний посуд і направляють  на мікробіологічне  дослідження.
При підозрі на туберкульозний менінгоенцефаліт, туберкульоз мозку або ураження нервової системи для досліджень відбирають спинномозкову рідину.
Для отримання більш достовірних результатів при мікробіологічних дослідженнях необхідно виконати певні умови:
- патологічний матеріал для мікробіологічних досліджень на МБТ повинен бути отриманий асептично;
- весь посуд при відборі чи в ході аналізу  повинен бути стерильним. Крім того, флакони для отримання сечі, пробірки, предметні скельця, інструменти, які використовуються в роботі, перед стерилізацією  піддаються прогріванню в сухожаровій  шафі (240 – 250  0С). Така обробка знищує МБТ, які знаходилися  в  патологічному матеріалі в попередніх дослідженнях  та кислотостійких сапрофітних мікобактерій, які могли  потрапити з водою в процесі миття  посуду.
Матеріалом для дослідження можуть бути також фекальні маси. Однак, при виявленні в них МБТ важко вирішити питання, з яких органів останні виділяються.
Підготовка патологічного матеріалу для мікробіологічних досліджень проводиться за загальноприйнятою схемою, яка спрямована на збагачення МБТ та знищення супутньої мікрофлори.
Патологічний матеріал тканин лімфатичних вузлів, отриманий  при біопсіях та оперативних втручаннях, піддається гомогенізації. Для цього матеріал вміщують в стерильну ступку і якомога ретельніше подрібнюють стерильними ножицями. До подрібненої маси дослідного матеріалу додають стерильний пісок в рівнозначній кількості, а потім доливають 0,5 - 1,0 мл стерильної дистильованої   води і все енергійно розтирають до утворення кашоподібної маси зподальшим  доливанням стерильної води в кількості 4,0 – 5,0 мл. Приготовлена суміш відстоюється протягом 1,0 - 1,5 години , верхню частину якої використовують для досліджень. Зливають в центрифужну пробірку, додають рівний об’єм 3,0 % Н2SО4, центрифугують 10 хв., осад засівають.
З метою знищення супутньої мікрофлори в разі потреби (при контамінації матеріалу мікроорганізмами) патологічний матеріал додатково оброблюють 3,0 - 5,0  % - ним розчином сірчаної кислоти в співвідношенні 1:1, добре змішують і дають відстоятися. Надосадну рідину центрифугують протягом 10-15 хвилин, але загальна експозиція дії кислоти не повинна перевищувати 20 хвилин. Потім надосадну  рідину зливають, а осад відмивають 1 - 2 рази стерильною дистильованою водою – центрифугуванням. Отриманий осад використовують для бактеріологічних посівів, зараження лабораторних тварин та мікроскопії. Існують також інші методи знищення супутньої мікрофлори в патологічному матеріалі.
Сеча в невеликій кількості центрифугується і отриманий осад оброблюють 4,0 % розчином NаОН за загальноприйнятою методикою або 5,0 % - ним розчином Н2SО4.
Отриманий пунктат з абсцесів, гній з свищів переносять в стерильний флакон зі скляними кульками в кількості 2,0 – 5,0 мл  і додають такий же об’єм  стерильної дистильованої води, або  ізотонічного розчину натрію хлориду.
Флакон закривають пробкою і ставлять в шутель-апарат, розбиваючи матеріал, що досліджується, протягом 8 - 10 хвилин. Гомогенізовану   масу використовують для подальших досліджень.
Харкотиння, що поступило для досліджень, підготовлюється згідно існуючих методик, при цьому використовуються методи збагачення МБТ та знищення супутньої  мікрофлори в патологічному матеріалі. 

 

 
 
3   МІКРОСКОПІЧНІ МЕТОДИ  ДОСЛІДЖЕННЯ ПРИ ПІДОЗРІ НА ТУБЕРКУЛЬОЗ
 
	Мікроскопія МБТ являється найбільш доступним і швидким методом виявлення мікобактерій. Загальноприйнятим бактеріоскопічним методом виявлення МБТ являється пряма мікроскопія мазків, а також мазків, приготовлених після збагачення (центрифугування, флотації, мікрофлотації) з послідуючим забарвленням традиційним методом за Цілем-Нільсоном.
	Метод прямої мікроскопії мазків при позалегеневих формах туберкульозу показав свою малу ефективність в зв’язку з олігобацілярністю патологічного матеріалу, а тому доцільно використовувати метод мікрофлотації. При цьому необхідно взяти відцентрифугований осад, додати 12 - 15 крапель 10,0 % розчину їдкого натрію і провести повну гомогенізацію. Потім долити 1/3 стерильної дистильованої води і додати 2 - 3 краплі ксилолу або іншого вуглеводню, щільно закрити резиновою пробкою і провести в горизонтальному положенні сильне струшування  протягом 5 - 7 хвилин. Після цього вміст пробірки центрифугують при 1500 об/хв. протягом 5 - 10 хвилин. На поверхні рідини утворюється сметаноподібна піна, яку знімають бактеріологічною петлею, готують мазки на предметному скельці. 
	Дуже важливо визначити життєздатність мікобактерій, оскільки вирішити це питання не можливо шляхом фарбування мазка за Цілем-Нільсоном. З цією метою приготовлений мазок фіксують над полум’ям, фарбують 1,0 %-ним розчином малахітового зеленого (рН 4,1) протягом 5 - 10 хвилин, підігріваючи мазок до появи парів. Після цього фарбу зливають, мазок промивають водою і забарвлюють карболовим фуксином (в розведенні 1:5) протягом 5 хвилин. Живі мікобактерії фарбуються в зелений колір, а нежиттєздатні -  в червоний. Цитохімічний метод визначення життєздатності мікобактерій застосовують для проб з великою кількістю мікобактерій.
	Предметні скельця використовуються лише нові. Мазки з позитивними результатами знищують в установленому порядку, так як на скельцях можуть зберігатися мікобактерії попередніх аналізів.
3.1   Пряма мікроскопія

	Мазок для мікроскопії готують, як правило, із осаду після центрифугування досліджуваного матеріалу (сечі, сперми), або отриманої дисперсії (операційного матеріалу, гною туберкульозних абсцесів, промивних вод, свищів та ін.). Препарат готують, рівномірно розподіляючи його по предметному скельцю, і добре висушують на повітрі. Інколи рекомендують робити мазки для мікроскопії із частини осаду залишеного після бактеріологічного посіву на дні центрифужної пробірки. Піпеткою відбирають 1 - 2 краплі осаду і наносять на предметне скельце. Після того як мазок добре висохне, його фіксують тричі проводячи через полум’я, забарвлюють за Цілем-Нільсоном і мікроскопують. При оцінці мазків на МБТ інколи виникає необхідність в диференціації  їх від інших кислотостійких паличок. Для цього рекомендується обробити мазок протягом 40 - 60 хвилин етиловим спиртом. Вважається, що типові МБТ при такій обробці колір не змінюють, в той же час сапрофітні мікобактерії змінюють його. Зустрічаються видозмінені форми МБТ під впливом антибактеріальних препаратів, які також не витримують такої обробки. Відомо, що на слизовій оболонці сечо-статевого каналу постійно паразитує кислотостійкий сапрофіт (M.smegmatis) і навіть застосування  катетера при відборі сечі не виключає їх попадання в пробу. Отже безпосередня мікроскопія сечі, сперми, секрету передміхурових залоз, менструальної крові, вміст свіщових ходів з метою виявлення МБТ являється малопридатним діагностичним методом.
	В останній час при мікроскопії можна спостерігати морфологічні і тинкторіальні зміни МБТ під впливом туберкулостатичних препаратів, що приводить до утруднення диференціації атипових  і сапрофітних мікобактерій. Відомо, що МБТ можуть частково змінювати кислотостійкість, набувати кулеподібної, сегментовидної форми, а також подвійних коків, розташованих бобоподібно,  як всередині  лейкоцитів, так і самостійно.
	Пряма мікроскопія мазка на МБТ є можливою, якщо в 1,0 мл дослідного матеріалу виявляється не менше 50 - 100 тисяч мікробних тіл і вірогідність позитивного результату досліджень залежить від стадії розвитку збудника та характеру ураження організму.
	Мікроскопія мазків харкотиння на МБТ являється найбільш доступним і швидким методом виявлення мікобактерій. Приблизно третина пацієнтів з бактеріовиділеннями може бути виявлена при першій мікроскопії фарбованих мазків. При мікроскопії мазків приготовлених із проб, взятих протягом декількох днів, діагностика бактеріовиділення підвищується до двох третин. Не має необхідності використовувати більше п’яти проб харкотиння, але приблизно в третини  хворих буде негативний мазок на МБТ, що залежить  від періоду та характеру ураження легень.

3.2  Методи збагачення

При дослідженні харкотиння, сперми, гною, сечі доцільно використовувати збагачення методом флотації, чи мікрофлотації, або кип’ятіння з розчином соди. 

3.2.1   Метод флотації
 
	Цей метод обов’язково використовується, якщо в досліджуваному матеріалі є мала кількість МБТ, а також при негативному результаті прямої бактеріоскопії. Методом флотації МБТ   виявляються у патологічному матеріалі  приблизно на 10,0 – 15,0 % частіше, в порівнянні з прямою бактеріоскопією. Для дослідження методом флотації харкотиння в об’ємі  12,0 – 15,0 мл поміщають у колбу 250,0 мл, додають таку ж кількість 0,5 % розчину їдкого натрію або калію  і для кращої гомогенізації струшують протягом 10 – 15 хвилин, потім до половини ємності колби наливають дистильовану воду із додаванням  0,5 мл ксилолу чи бензину. Весь вміст струшують 5 – 10 хвилин, після чого доливають дистильовану воду до повного     об’єму  - 250,0 мл, через 30 – 60 хвилин крапельки бензину (ксилолу) спливають на поверхню, захоплюючи за собою МБТ і концентруючи їх у невеликому об’ємі утвореного на поверхні кільця. Флотаційне кільце піпеткою переносять на предметне скельце. Препарат фарбують за Ціль-Нільсоном.
	При флотації промивних вод, гною, ексудату, спинномозкової рідини та іншого матеріалу, які не потребують гомогенізації, додають меншу кількість розчину лугу (від 1,0 –  2,0 мл в залежності від кількості матеріалу). В подальшому виконують те саме, що і при флотації харкотиння. 

3.2.2  Кип’ятіння з содовим розчином
 
	Харкотиння хворого збирають у кишенькову плювальницю в кількості 10 – 20 мл. Туди додають рівний об’єм стерильного 5,0 % розчину харчової соди (бікарбонату натрію), ставлять на водяну баню і кип’ятять протягом 45 хвилин з моменту закипання води. Далі вміст виливають в центрифужні пробірки, центрифугують при 1500 об/хв. протягом 25 – 30 хвилин, над осадову рідину зливають, а з осаду роблять тонкі мазки, фарбують за Ціль-Нільсоном і мікро скопують під імерсійною системою світлового мікроскопу.
	Метод набув широкого використання в Україні завдяки простоті використання та безпеці роботи з ним. 

3.3   Люмінесцентна мікроскопія

	В останні роки усе більш широке застосування в мікроскопічній мікробіологічній діагностиці туберкульозу знаходить люмінесцентна мікроскопія. Даний метод мікроскопії заснований на здатності мікобактерій сприймати люмінесцентні барвники і потім світитися при опроміненні ультрафіолетовими променями. При цьому в залежності від застосовуваних барвників мікобактерії дають яскраво-червоне світіння на зеленому, чи золотавожовте на темнозеленому тлі поля зору.
	Існує ряд методик забарвлення препаратів для люмінесцентної мікроскопії: акрединовим жовтогарячим; аураміном і родаміном по Бою; аураміном по Хагеману; аураміном по Хагеману в модифікації  Набонна.
	Для забарвлення препаратів акрединовим жовтогарячим необхідні наступні реактиви: акрединовий жовтогарячий,  3,0 % солянокислий спирт, метиловий спирт, 10,0 % розчин аміаку. З акрединового жовтогарячого готується основний розчин шляхом розчинення 1,0 г барвника в 100,0 мл дистильованої води. З основного розчину готується робочий розчин шляхом додавання 10,0 мл основного розчину до 990,0 мл дистильованої води. Сюди ж додається 3 - 6 крапель 10,0 % розчину аміаку, рН  повинний бути не менше 9,0. Мазки готують з осаду, отриманого при обробці матеріалу для посіву, краплю якого наносять на скельце  звичайним способом. Препарати фіксуються метиловим спиртом протягом 3 - 5 хвилин. Скельця для препаратів повинні бути новими, тонкими і без подряпин. Забарвлення препаратів здійснюють шляхом занурення фіксованих мазків у робочий розчин акрединового жовтогарячого на 24 години без підігріву. Потім мазки двічі по 10 хвилин знебарвлюють 3,0 % солянокислим спиртом, промивають дистильованою водою, висушують у термостаті і мікроскопують.
	Для забарвлення препаратів аураміном і родаміном по Бою необхідні наступні реактиви: аурамін 00, родамін С, 3,0 % солянокислий спирт, 0,25 % водяний розчин метиленової синьки. Родамін С можна заміняти подвійною кількістю родаміна 6 Ж. Робочий розчин аураміну і родаміну готується шляхом додавання 1,0 г аураміну і 0,1 г родаміну до 1000,0 мл дистильованої води. Фіксований над полум’ям пальника мазок забарвлюють протягом 10 хвилин робочим розчином при легкому підігріванні, потім мазок промивають водою, знебарвлюють 3,0 % солянокислим спиртом і знову промивають водою. Гасіння тла роблять шляхом забарвлення препарату 0,25 % розчином метиленового синього, після чого препарат промивають водою, висушують на повітрі і мікроскопують.
	Методика забарвлення препарату по Хагеману в модифікації Набонна (аураміновий метод): на фіксований мазок наливають розчин аураміну 00 на 15 хвилин (мазок нагрівається над полум’ям пальника до появи парів), потім препарат ретельно промивають водою, знебарвлюють солянокислим спиртом 3 - 5 хвилин, промивають водою, дофарбовують розчином кислого фуксину протягом 2 хвилин, ретельно промивають водою, висушують і мікроскопують. Забарвлені препарати мають малиново-червоний колір. При люмінесцентній мікроскопії клітини мікобактерій світяться золотаво-зеленим кольором на темному чи бурувато-червоному тлі.
	Методика забарвлення препаратів по Бою в модифікації Полякової: фіксовані препарати забарвлюють розчином, що містить аурамін (1:1000) і родамін С (1:10000) протягом 20 хвилин. Потім препарат промивають водопровідною водою і знебарвлюють 3,0 % солянокислим спиртом протягом 3 - 5 хвилин. Потім цей препарат знову промивають водою і після гасіння тла 0,25 % розчином метиленової синьки протягом 1 - 2 хвилин, промивання водою і висушування, він готовий до мікроскопії. При даному методі забарвлення  в препаратах при люмінесцентній мікроскопії клітини мікобактерій мають золотаво-жовтогарячий колір.
	При люмінесцентній мікроскопії необхідно правильно (відповідно до інструкцій) користуватися освітлювальною апаратурою. Дослідження препаратів здійснюється методом мікроскопії (40 х 10). Позитивна відповідь дається при виявленні не менш 3-х клітин мікобактерій у препараті. Кількість клітин мікобактерій оцінюється також, як і в методиці світлової мікроскопії препаратів, пофарбованих за Цілем-Нільсоном.
	Люмінесцентний метод мікроскопії підвищує результативність досліджень по виявленню клітин мікобактерій у досліджуваному матеріалі на 18,0 – 20,0 % у порівнянні зі світловою мікроскопією препаратів з нативого  матеріалу і на 8,0 – 10,0 % - препаратів з матеріалу після збагачення. Слід зазначити, що люмінесцентна та пряма мікроскопія не дає можливості диференціювати МБТ від сапрофітних та умовно-патогенних мікобактерій. 

3.3.1   Приготування барвників і реактивів для люмінесцентної мікроскопії

	Розчин аураміну 00 і родаміну С (для забарвлення по Бою): 
1,0 г аураміну і 0,1 г родаміну С розчиняють у 1000 мл дистильованої води (для цього розчину можна застосовувати родамін 6 Ж в кількості 0,2 г на 1000 мл дистильованої води).
	Розчин аураміну 00 (для забарвлення по Хагеману): 1,0 г аураміну 00 розчиняють у 1000,0 мл дистильованої води. У фарбу додають 5,0 мл 5,0 % розчину карболової кислоти. Водний розчин аураміну 00 не повинний давати пластівців при додаванні в нього карболової кислоти.
	Основні розчини флюорохромів можуть зберігатися в темряві багато місяців у темних флаконах, закритих скляними притертими  пробками чи гумовими пробками, обгорненими алюмінієвою фольгою. Робочі розчини не повинні зберігатися більше 6 - 7 діб. Фільтрувальний папір застосовувати не можна. Якщо барвник розчинений не цілком і є осад, флакон з розчином на кілька годин можна помістити в термостат при 37  0С.
	3,0 % солянокислий спирт (для забарвлення по Бою): 3,0 мл соляної кислоти додається до 97,0 мл 70,0 % спирту.
0,25 % розчин метиленової синьки: до 100,0 мл дистильованої води додається 0,25 г метиленового синього.
Кислий фуксин (для забарвлення по Хагеману): 1,0 г кислого фуксину розчиняється в 390,0 мл дистильованої води. До цього розчину додається 10,0 мл концентрованої оцтової кислоти.
Солянокислий спирт (для знебарвлення препаратів при забарвленні по Хагеману: до 90,0 мл спирту-ректифікату, налитого в градуйовану посудину, доливається 4,0 мл концентрованої соляної кислоти, що димить, і висипається 4,0 г хімічно чистої кухонної солі. Потім у посудину доливається дистильована вода до мітки 100,0 мл (частина нерозчиненої кухонної солі залишається в осаді).

3.4   Фазовоконтрастна  мікроскопія

	Фазовоконтрастна  мікроскопія є єдиним мікроскопічним методом дослідження, що дозволяє спостерігати клітини мікобактерій і їх біологічно змінені форми в живому стані. Для її здійснення до звичайного світлового мікроскопу застосовується спеціальне фазовоконтрастне  пристосування КФ-4.
	З методів фазовоконтрастної мікроскопії найбільше широко застосовується методика дослідження препаратів, приготовлених по типу препарату, що одержав назву «роздавлена крапля». Для готування даного препарату беруть чисте знежирене предметне скельце. На поверхню даного скельця бактеріальною петлею чи піпеткою наносять краплю рідкої суспензії досліджуваних  мікобактерій чи їх біологічно змінених форм, покривають краплю чистим і фламбірованим над полум’ям пальника покривним склом так, щоб між предметним і покривним скельцями не було пухирців повітря. Препарат поміщають на предметний столик мікроскопа і відповідно до правил здійснюють фазовоконтрастну мікроскопію сухою системою. При цьому в полі зору мікроскопа стають помітними живі клітини  мікобактерій чи їх біологічно змінені форми. Для здійснення фазовоконтрастної мікроскопії імерсійним методом, на поверхню покривного скельця наносять краплю імерсійної олії, занурюють у неї імерсійний об’єктив і здійснюють мікроскопію. При цьому у полі зору  спостерігають великі за розмірами живі клітини мікобактерій і їх біологічно змінені форми, окремі деталі їх структури.

 

 
4   КУЛЬТУРАЛЬНІ МЕТОДИ  ДОСЛІДЖЕННЯ ПРИ ПІДОЗРІ НА ТУБЕРКУЛЬОЗ
 
	Хворий на туберкульоз в процесі антибактеріального лікування може виділяти МБТ морфологічно змінені та в малій кількості, які не можливо  виявити  бактеріоскопічними методами. Тому в комплексі досліджень, спрямованих на виявлення МБТ, обов’язковим є посів патологічного матеріалу на живильні середовища для виділення культури МБТ. Виділення культур МБТ дає змогу визначити життєздатність збудника, його медикаментозну чутливість, ферментативну активність та вірулентність.
	В останні роки у зв’язку з широким використанням протитуберкульозних препаратів у 19,0 – 20,0 % випадків спостерігається диспропорція між виявленням МБТ при бактеріоскопічному дослідженні та їх ростом при посіві патологічного матеріалу на живильні середовища. Це явище зустрічається тому, що МБТ, які спостерігаються під мікроскопом, не ростуть на загальноприйнятих живильних середовищах. Така дисоціація зумовлена впливом на МБТ лікарських препаратів.
Для культуральної діагностики, особливо позалегеневої локалізації туберкульозу, застосовують широкий комплекс живильних середовищ. Це пов’язано  з частою олігобацилярністю, а також з пониженням життєздатності і ферментативної активності МБТ. Для отримання більш достовірних результатів доцільно використовувати живильне середовище ВКГ з паралельним використанням традиційних класичних середовищ (Льовенштайна-Єнсена та ін.). Ріст перших колоній на класичних середовищах з’являється через 30-60 діб, тоді як на середовищі ВКГ через 2-3 доби. Мікобактерії туберкульозу олігобацилярних форм та клітини зі зниженою життєздатністю і ферментативною активністю також проявляють ріст на вищезгаданому живильному середовищі через 2 – 3 доби.  
 Обов’язковим є постановка досліду по контролю якості живильного середовища ВКГ перед початком використання нової серії живильного середовища ВКГ (Свольска С., 1999). 

4.1   Постановка досліду по контролю якості живильного  середовища ВКГ

	Тритижневі культури M.tuberculosis Н37Rv, вирощені на середовищі Льовенштайна-Єнсена, знімають бактеріологічною лопаткою і  змішують зі стимулятором  росту з розрахунку 1-2 млн мікробних тіл  у 1,0 мл суспензії. Суспензію витримують у термостаті при 37 0С 48 годин, після чого пересівають на чашки Петрі зі свіжоприготованим живильним середовищем ВКГ. У чашку Петрі вносять 1,5 мл суспензії і рівномірно розподіляють по всій поверхні середовища, чашки Петрі не перевертають і герметично закривають клейкою стрічкою (скотчем). Посіви переглядають щодня і інкубують до 10 діб.  З появою росту культури, відзначають початок росту, готують два мазки, один із яких забарвлюють за Цілем-Нільсоном, другий - водно-спиртовим розчином метиленового синього. 	
З кожної серії живильного  середовища і стимулятора відбирають по 3 пробірки зі стимулятором і по 3 чашки з живильним  середовищем для контролю стерильності.
	На живильному середовищі після  добової експозиції в стимуляторі росту штам M.tuberculosis Н37Rv дає візуальний ріст, починаючи з 3 доби, рясний газонний ріст культури фіксується на 4-5 добу.
	При збільшенні експозиції в стимуляторі на 1 добу підсилюється інтенсивність росту штаму M.tuberculosis Н37Rv - незначний ріст визначається візуально починаючи з 2 -ої доби інкубації, газонний ріст культури - на 3-ю добу спостереження.
	Штам M.tuberculosis Н37Rv на щільному живильному середовищі ВКГ має характерні культуральні властивості: колонії соковиті, трохи матові з жовтуватим відтінком, по консистенції восково-маслянисті, легко відокремлюються від агару.
	При мікроскопії в першу добу МБТ проростають у виді кулеподібних і овоїдних клітин, що переходять з часом у диплококові і паличкоподібні форми. На 5-у добу виявляється велика кількість паличкоподібних форм, що поступово переходять в колбоподібні клітини.
	За Цілем-Нільсоном мікробні клітини не забарвлюються. Однак, добре забарвлюються простими методами - розведеним фуксином і водно-спиртовим розчином метиленового синього.
	Вищезгадане живильне середовище ВКГ зареєстровано в Україні за № 221 / 00 – 3002 00 000, відповідає вимогам державних та міжнародних стандартів (Свольска С.  Экспертное заключение ВОЗ по микробиологии туберкулеза. - Варшава, 1999).
Перед тим, як направляти діагностичний матеріал на посів, хворому потрібно не менше, ніж на 1 добу відмінити протитуберкульозні препарати.
	Передпосівну обробку патологічного матеріалу з метою деконтамінації і покращення гомогенізації проводять кислотами, лугами і різними детергентами згідно загальноприйнятих методик.
	Після підготовки діагностичного матеріалу його центрифугують, отриманий осад для посіву на середовище ВКГ обробляють стимулятором росту, який входить до комплексу ВКГ (окремий 10,0 мл флакончик з рідиною) в співвідношеннях 1:1, а отриману в асептичних умовах кров розводять стимулятором росту – порівну. Отриману суспензію (дослідний матеріал + стимулятор росту) інкубують при температурі  37,0 ± 1,0  0С протягом 24 - 48 годин. Живильне середовище ВКГ готується безпосередньо перед застосуванням.  Для цього береться 9,0 г сухого середовища ВКГ, розмішують його в 100,0 мл дистильованої води, кип’ятять  2 - 3 хвилини до повного розплавлення агару, фільтрують через ватно-марлевий фільтр, розливають у відповідний посуд, стерилізують (121,0 ± 1,0 0С) протягом 15 хвилин у автоклаві. Після стерілізації розливають в асептичних умовах у стерильні чашки Петрі шаром 6,0 –8,0 мм. Готове живильне середовище жовтого кольору і повинно відповідати рН 7,2 ± 0,2. Для цього дистильовану воду для його приготування треба брати з рН 7,2 ± 0,2.  Після застигання середовища негайно проводять посів за допомогою шприца одноразового використання у дозі 1,5 мл на чашку Петрі. Засіяний матеріал, не перевертаючи чашки, поміщають у термостат при температурі  37,0 ± 1,0  0С  для виявлення росту.
	Для підвищення ефективності культуральної діагностики та доцільності контролю контамінації патологічного матеріалу, який підготовлений з стимулятором росту, посів проводять по загальноприйнятій методиці на додаткові живильні середовища – жовточно-сольовий агар і 5,0 % кров’яний агар.
	Оцінка результатів на живильному середовищі проводиться візуально щодня протягом 10 діб. Ріст колоній на середовищі ВКГ проявляється у вигляді злегка жовтуватих непрозорих колоній або газонного росту, як правило, на другу-третю, а інколи на четверту добу. Наявність росту колоній на інших живильних середовищах вказує на не стерильне приготування патологічного матеріалу для бактеріологічного посіву. 
	Отримані культури на живильному середовищі ВКГ використовуються для приготування мазків за загальноприйнятою методикою та забарвлюються або за Грамом, або за Цілем-Нільсоном, або простими методами. У першу добу МБТ проростають у вигляді кулеподібних і овоїдних клітин, що переходять з часом у диплококові і паличкоподібні форми, які поступово переходять у колбоподібні  клітини. За Цілем-Нільсоном в цей час  бактерії не забарвлюються. Однак, добре забарвлюються простими методами – розведеним фуксином і водно-спиртовим розчином метиленового синього.
Для верифікації олігобацилярної культури мікобактерій необхідно зробити її змив. На живильне середовище наносять 2,0 – 3,0 мл стерильної дистильованої води (не фізіологічного розчину !) та за допомогою пастерівської піпетки відсмоктують отриману суспензію, переносять у стерильну центрифужну  пробірку, додають 12 - 15 крапель 10,0 % розчину їдкого лугу, добре струшують до повної гомогенізації і центрифугують при 1500 обертах 10 хвилин. Отриманий осад використовують для посіву на середовища Льовенштайна-Єнсена і Фіна-2 (але без малахітового зеленого). Одержати ріст МБТ (бацилярної форми) стає можливим на середовищі Фіна–2 – на 10 -16 добу, на середовищі Льовенштайна-Єнсена –  пізніше – на 18 - 25 добу. Приготовлені мазки культур у початковий період росту на цих живильних  середовищах дозволяють знайти велику кількість дрібних і великих кулеподібних форм, іноді гіллястих. Однак, щоденна мікроскопія показує поступове збільшення паличкоподібних форм, які розташовуються зрідка паралельно, іноді під кутом чи скупченнями різної форми, але частіше зустрічаються нитковидні утворення, що складаються з паличок, вигнутих по довжині, іноді дугоподібних, потовщених на одному чи обох кінцях. Клітини в цей період не забарвлюються за Цілем-Нільсоном. У процесі подальшого росту ниткоподібні утворення деструктуризуються  і розпадаються з утворенням паличкоподібних форм – характерних для МБТ – тонких, паличкоподібних клітин з характерною властивістю кислотостійкості.	    
	Запропоновану методику посіву вважають дуже інформативною, а в разі необхідності проводять біологічну пробу з використанням морських свинок.
	Для швидкої ідентифікації олігобацилярного матеріалу можна використовувати метод посіву в рідкі середовища з радіометричною індикацією росту або флуоресцентною індикацією (MGIT), але використання цих способів дуже дороге. В практичних лабораторіях можна використати метод мікрокультивування мікобактерій на скельцях за Прайсом. З отриманої культури готують суспензію, тобто в чашку Петрі з культурою додають по краплі дистильовану воду в кількості 5,0 мл. Отриману суспензію переносять пастерівською піпеткою в центрифужну пробірку і центрифугують 1-2 хвилини. З надосадної рідини готують мазки на вузьких скельцях. Мазки роблять на 1/3 частині стерильного вузького предметного скельця, яке укладають в стерильну кювету, підсушують в термостаті при 37 0С протягом кількох годин, потім заливають на 1-2 хвилини 3,0 %-им розчином сірчаної кислоти для фіксації. Після видалення кислоти мазки тричі відмивають стерильною водою і занурюють у пробірки з живильним середовищем. Як живильне середовище використовується свіжа цитратна гемолізована донорська кров. Кров від донора збирається в стерильну колбу з 5 %-им розчином цитрату натрію. Цитратна кров гемолізується стерильною дистильованою водою в співвідношенні 1:10. Гемолізована кров над полум’ям  пальника розливається по 5,0 мл у стерильні пробірки.
	Облік результатів проводиться через 8 - 10 діб інкубації в термостаті при 37 0С. Після закінчення цього терміну пробірки з мазками автоклавують, обережно відмивають водою від крові, підсушують, фіксують над полум’ям, забарвлюють за Ціль-Нільсоном і мікроскопують під малим збільшенням мікроскопа. При позитивному результаті в мазках одержують характерні мікроколонії, що представляють собою забарвлені в червоний колір переплетені джгути, так звані “коси”, які складаються з великої кількості щільно притиснутих  одна до одної клітин. Корд-фактор (трегалоза–6,6–диміколат), що забезпечує зближення бактеріальних клітин у мікроколоніях, забезпечує ріст у вигляді серпантиновидних “кіс”  і має відношення до вірулентності збудника. Слід зазначити, що предметне скельце повинно бути лише новим, без подряпин, добре відмитим, обезжиреним в суміші Нікіфорова і простерилізованим. 
	Важливим при диференціації є виявлення відсутності термостабільної каталази, що вказує на наявність патогенності M.tuberculosis або M.bovis.
  
5	ВИЗНАЧЕННЯ ЧУТЛИВОСТІ ДО ЛІКУВАЛЬНИХ ПРЕПАРАТІВ

	Визначення спектру і ступеня чутливості МБТ до протитуберкульозних препаратів (ПТП) має суттєве значення для тактики хіміотерапії хворих, для контролю за ефективністю лікування і визначення прогнозу захворювання. Зміна чутливості мікобактерій визначається до всіх ПТП. Чутливими до ПТП вважаються ті МБТ, на які препарат у концентрації, що досягається у вогнищі інфекції, створює бактеріостатичну і бактерицидну дію, незалежно від поза- або внутрішньоклітинного їх розташування.
	Відповідно до цього, критерії чутливості МБТ залежать від концентрації ПТП у вогнищі ураження, величини максимальної терапевтичної дози препарату, його мінімальної інгібуючої концентрації (МІК). МІК  ПТП вимірюється його мінімальною концентрацією, що затримує ріст абсолютно всіх штамів МБТ, виділених у нелакованих хворих. Розподіл МБТ на чутливі і стійки відбувається на підставі критеріїв, що встановлені клініко-лабораторними дослідженнями. Критерії резистентності мають бути вищими за МІК у 2 – 3 рази. Межове значення для визначення стійкості МБТ до ізоніазиду – 1,0 мкг/мл, рифампіцину – 10,0 мкг/мл, стрептоміцину – 5,0 мкг/мл, канаміцину – 30,0 мкг/мл, етіонаміду і протіонаміду – 30,0 мкг/мл, етамбутолу – 5,0 мкг/мл.
	Визначення чутливості МБТ до ПТП може проводитися бактеріологічними методами – методом розведення в щільному живильному середовищі і методом розведення в рідкому живильному середовищі. Існують модифікації  обох методів.
	Модифікації методу визначення чутливості до ПТП в рідкому середовищі представлені методом глибинного посіву мікобактерій і методом мікрокультивування на скельцях. Безумовно, методи визначення чутливості мікобактерій у рідких середовищах більш трудомісткі, вимагають приготування мазків, їх забарвлення і мікроскопування, дотримання високої стерильності. Проте, отримані результати одержують у більш короткі терміни.
	Модифікації методу визначення чутливості до ПТП на щільному середовищі представлені методом абсолютних концентрацій на яєчних середовищах і методом пропорцій в агарових середовищах. Визначення чутливості при цьому відбувається шляхом засіву  дозованої кількості мікобактерій, що дозволяє більш точно визначити ступінь їх чутливості.
	В останні роки отримав розповсюдження метод оцінки чутливості МБТ з використанням технології Etest.  Etest  для етамбутолу (код ЕВ, Article № 5100 2770), етіонаміду (ЕТ, Article № 5100 2750), ізоніазиду (ІZ, Article № 5100 2790), рифампіцину (RI, Article № 5100 2170), канаміцину (KM, Article № 5100 2780) складається з непористої пластикової смуги, каліброваної препаратом по градієнту концентрації (MIC мкг/мл - 0,016 – 256,0; AB BIODISK, Sweden). Еtest для стрептоміцину (SM, Article № 5100 2680) калібрований препаратом концентраціями в мкг/мл від 0,064 до 1024,0. При накладанні  смужки на дифузійний агар градієнт концентрації антибіотика, встановлений у смужці і переданий в агар залишається стійким протягом усього періоду дослідження (Wanger A., Mills K., 1996) .
	З випробуваних культур готують суспензії по стандарту каламутності (3.0-4.0 McFarland) і вносять у дифузійні середовища. Надлишок вологи видаляють, агар підсушують 10 хвилин. Рекомендується попереднє культивування протягом 24 годин. Потім на чашки накладають відповідні Etest смуги. Після інкубації з 5,0 % СО2  роблять  облік з моменту появи чітко окресленого  еліпсу в середньому через 5-10 діб. 
	Для дифузного агару можна використовувати  Middlebrook 7H11 Agar з 10,0 % Oleic Acid + Albuminum + Dextrose (OADC) або Muller Hinton Agar з 5,0 % Defibrinated Horse Blood (DHB) чи Defibrinated Sheep Blood (DSB), або 5,0 % OADC чи Horse Blood (HB).
	Для підвищення ефективності і зниження собівартості дослідження можна використовувати наступні методики: визначення чутливості до лікарських препаратів з використанням рідких і щільних живильних середовищ.
 
5.1	Визначення чутливості МБТ до лікувальних препаратів з використанням
кров’яного  живильного середовища
 
Роблять змив культури, яку отримали на живильному середовищі ВКГ за методикою, яка описана вище. 
З надосадної рідини, концентрація мікробних тіл у якій приблизно відповідає стандарту каламутності 5 одиниць, на вузьке скельце у кюветі наноситься 2 краплі на 1/3 скельця. Далі роблять те саме, що і при культивуванні МБТ. Мазки занурюють у пробірки з живильним середовищем, у якому розведені різні концентрації  антибактеріальних препаратів, а також середовищем без препаратів (контроль).
Зроблені в такий спосіб посіви культури в кров'яне середовище, що містить антибактеріальні препарати, і контроль інкубуються при 37 0С  10 діб. Підготовка мазків до обліку робиться за загальноприйнятою методикою – (метод Прайса).

5.1.1   Облік результатів:

а) якщо мікроколонії виявляються тільки в контрольних мазках, а в інших мазках спостерігаються лише поодинокі клітини, то вони є чутливими до даної концентрації препарату.
б) якщо в мазках, що культивувалися в середовищі з антибактеріальним препаратом, виявляються такі ж мікроколонії, як і в контрольних мазках, то такі мікобактерії є стійкими до даного препарату.
в) якщо в мазку, що культивувався в середовищі з яким-небудь препаратом, виявляються мікроколонії поряд з поодинокими клітинами, це значить, що дана популяція мікобактерій містить як чутливі, так і стійкі МБТ.
При відсутності  росту чи наявності лише поодиноких мікроколоній у контрольних мазках облік не проводять, і дослід варто повторити. Результати досліду також не враховуються при відсутності МБТ у контрольних  мазках, незважаючи на можливий ріст або інгібування МБТ у мазках, які культивувалися в середовищах із препаратами.
 
5.2	Визначення чутливості МБТ до лікувальних препаратів з використанням
 середовища ВКГ
 
Роблять змив культури, яку отримали на живильному середовищі ВКГ за методикою, яка описана вище.
Готують середовище ВКГ в чашках Петрі і висівають 1,0-1,5 мл приготованої суспензії – контроль росту мікобактерій, а потім готують середовище ВКГ, в яке додають розведення протитуберкульозних препаратів (серійні подвійні розведення лікувального препарату за загальноприйнятою методикою) і після застигання середовища на чашки Петрі висівають в тій же дозі (1,0-1,5 мл) приготовлену суспензію. Засіяні чашки, не перевертаючи, ставлять в термостат і спостерігають за ростом протягом 5 діб. Наявність росту культури на контрольному середовищі і пригнічений або відсутній ріст на чашках Петрі з антибактеріальними препаратами вказує на повне або часткове пригнічення росту мікроорганізмів, тобто на повну або часткову стійкість до даного ПТП. 
 
5.3   Інші методи визначення чутливості МБТ до лікувальних препаратів
 
	За останній час розроблені комерційні тестові системи для визначення чутливості in vitro, основані на методах дифузії і розведення (bio Meriex, Франція; Roche Diagnostics, Швейцарія; Giles Scentific, США та ін.). Використовують також тести з флуоресцентною індикацією (MGIT) і ДНК полімеразний метод (ПЛР – метод) системи Amplicor I Genprobt та ін. Всі ці тести поки що недоступні для широкого розповсюдження по Україні. В останні роки розроблюються і вітчизняні тестові системи для визначення стійкості МБТ до протитуберкульозних препаратів, які проходять клінічну апробацію. 
  
РEЗЮМЕ
 
	На підставі експериментального вивчення біологічного розвитку M.tuberculosis у лабораторії мікробіології туберкульозу ІФП і Вінницької проблемної лабораторії по вивченню мікробіології туберкульозу рекомендується для впровадження в практику регіональних бактеріологічних лабораторій новий метод діагностики, що базується на застосуванні розробленого в Україні живильного середовища ВКГ. Метод не виключає застосування традиційних рутинних методів дослідження при індикації й ідентифікації МБТ.
З впровадженням методу з’явилась  можливість виділяти культури МБТ за 2-3 доби з будь-якого досліджуваного матеріалу, у тому числі з крові (без попередньої її обробки). Метод дозволяє швидко визначати чутливість МБТ до лікарських препаратів.

ПЕРЕЛІК ЛІТЕРАТУРНИХ ДЖЕРЕЛ
1.	Власенко В.В. Туберкулез в фокусе проблем современности. - Винница: Наука, 1998. – 35 с. 
2.	Драбкина Р.О. Микробиология туберкулеза. – М: Медицина, 1963. – 255 с. 
3.	Мельник В.М. Позалегеневий туберкульоз в Україні – погляд у ХХІ століття // Укр. пульмонологіч. журн. – 1999. - № 4. – С. 52 - 54. 
4.	Туберкульоз позалегеневої локалізації / Ю.І.Фещенко, І.Г.Ільницький, В.М.Мельник, О.В.Панасюк . -  Київ: Логос, 1998. – 376 с. 
5.	Фещенко Ю.І., Мельник В.М. Туберкульоз легень в період епідемії: епідеміологічні, клініко-діагностичні, лікувально-профілактичні та організаційні аспекти. - Київ: Логос, 1998. – 282 с. 
6.	 Свольска С. Экспертное заключение ВОЗ по микробиологии туберкулеза. - Варшава, 1999. – 2 с. 
7.	Wanger A., Mills K. Testing of Myсobacterium tuberculosis susceptibility to ethambutol, isoniazid, rifampin and streptomycin by using Etest // J. of Clinical Microbiology. - 1996. – V.34, № 7. – P.1672 - 1676. 

Сертифікат про державну
реєстрацію №221/00 – 3002 00 000
 
Середовище ВКГ 
(середовище  зі  стимулятором росту  для   прискореного  виявлення мікобактерій   туберкульозу) 
 
Середовище ВКГ  призначене для прискореного  виявлення мікобактерій   туберкульозу: стимулятор  - для  прискорення росту, живильне середовище - для культивування мікобактерій. Стимулятор росту - стерильна, прозора, безбарвна рідина  (допускається жовтуватий відтінок).
До 5,0 мл стимулятору росту додають  у асептичних умовах за допомогою стерильного шприця 1,0-1,5 мл підготовленого інфікованого матеріалу (відбір і підготовка матеріалу здійснюється за загальноприйнятою методикою бактеріологічних досліджень згідно  Наказу №558 від 08.07.78 року та чинної  методичної НД).  Стимулятор росту забезпечує виділення мікобактерій із крові без її попередньої обробки.  Отриману суспензію інкубують у термостаті при  температурі  (37,0   1,0) 0С протягом 24 - 48 годин  і  висівають  на живильне середовище.
Живильне середовище (дрiбнодисперсний,   гігроскопічний   порошок кремового  кольору) у  кількості, зазначеній на етикетці,  розмішують  в 1,0 л  стерильної дистильованої  води,  кип’ятять  2-3 хвилини до повного розплавлення агару, фiльтрують  через ватно-марлевий фільтр, розливають у відповідний посуд, стерилiзують при  (121,0  1,0) 0С протягом 15 хвилин у  автоклаві. 
Готове  середовище жовтого  забарвлення з  рН  7,2  0,2,  використовують протягом 1 місяця  за  умови зберігання його при (6,0  2,0) 0С. 
Перед посівом  живильне  середовище  розплавляють  на водяній бані і розливають в асептичних умовах у стерильні чашки Петрі шаром 6-8 мм. В чашку Петрі зі свіжорозплавленим живильним середовищем вносять 1,5 мл  суспензії (інфікованого матеріалу у стимуляторі росту), рівномірно розподіляючи її по всій поверхні. Чашки Петрі не перевертають !!!, герметизують прозорою липкою стрічкою та інкубують при (37,0  1,0) 0С протягом  10 діб. Посіви продивляються щоденно. Візуально можна  виявити  характерний  ріст  мікобактерій уже   через  24 - 48 годин.
 Стимулятор росту розлито  по  5,0 , 100,0 , 200,0 мл.    Живильне    середовище  розфасовано по 100,0 , 250,0 , 500,0 г.   Зберiгають середовище ВКГ у  герметично  закритій   упаковцi  у  темному примiщеннi з вiдносною  вологiстю  не бiльше 60,0 %   при температурі вiд  5  до 25 0С.
Термiн придатностi середовища ВКГ - 18 місяців.
Переваги середовища ВКГ:
 виділення культури МБТ за 2-3 доби
 виділення культури МБТ із крові без її попередньої обробки
 діагностика як легеневого, так і позалегеневого туберкульозу
 швидке визначення чутливісти МБТ до лікарських препаратів
        Розробка: ЗАТ “Ганза”, Київ, вул. Фрунзе, 59.
                           Тел.: 8 - (044) – 462 – 52 – 02, 463 – 71 – 33
Виробництво: ДЕЗМП ІБОНХ НАНУ спільно с ЗАТ “Ганза”, Київ, вул. Зрошувальна, 15 а.
                           Тел.: 8 – (044) – 568 – 32 – 09